简介
本书介绍了蛋白质纯化技术，对基本原理及应用实例作了详细的阐述。全书共十一章，主要内容包括：蛋白质样品的预处理，凝胶过滤色谱，离子交换色谱，亲和色谱，共价色谱，电泳技术，特殊用途蛋白质的纯化，不同来源蛋白质的纯化，蛋白质的常用指标分析以及实验部分。书中不少内容在国内还是首次被系统介绍。
本书适合综合性大学及农、医、师范等高校相关专业教师和学生使用，也可供从事生物技术、医药工业和食品技术等相关工业领域及研究院所的研发人员参考。
[前言] 前言蛋白质是一切生命活动的主要体现者和物质基础。随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，这进一步促进了蛋白质组学和蛋白质工程研究的发展。蛋白质研究已成为当前生物化学和分子生物学领域内最为活跃的研究之一。要研究蛋白质的结构和功能，首先要得到高纯度的具有生物学活性的目的蛋白。而蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物的形式存在，每种类型的细胞都含有很多不同结构和功能的蛋白质，这使蛋白质的分离纯化成为一项精细而复杂的任务。虽然通过分子生物学手段可推导出蛋白质一级结构链的氨基酸排列顺序和组成，但仍有许多问题需要通过对蛋白质本身的空间结构和表达模式的研究才能得以更好的解释和完善。此外，利用蛋白质工程对蛋白质的结构进行改造，也必须先要了解蛋白质的基本结构。蛋白质的分离纯化是广大生物学、化学和医学工作者十分关心并且长期深入研究的领域，在获得高纯度目的蛋白后，才能够进行其性质的研究，从而有可能大规模生产应用，以造福人类。因此，蛋白质纯化不论是在基础理论研究、揭示生命现象的本质方面，还是在蛋白质工程、基因工程和细胞工程等产品的工业化生产方面，都是非常基础、非常重要、非常关键的。本书全面系统而深入地介绍了蛋白质纯化理论，并且将理论和实践联系，便于读者系统了解蛋白质纯化技术理论和具体实践应用过程。书中既介绍了基本实验步骤，也介绍了综合性蛋白质纯化研究的实例。全书主要内容包括：蛋白质样品的预处理，凝胶过滤色谱，离子交换色谱，亲和色谱，共价色谱，电泳技术，特殊用途蛋白质的纯化，不同来源蛋白质的纯化，蛋白质的常用指标分析以及实验部分。本书由陆健、周楠迪、史锋、曹钰、王栋、孔维宝编写。几位年轻老师，充分利用在国外学习、研究的时间，结合亲身研究经历，收集了很多资料，并进行了归纳整理。李胤、赵海峰、李旺军、蔡国林、冯凌蕾、刘军、王璐等参与了资料整理以及部分计算机文字处理工作，全书由陆健统稿、定稿。由于作者水平所限，加之时间仓促，书中可能存在许多不足，真诚期待广大读者赐教。衷心感谢化学工业出版社对本书的大力支持。
目录
1 绪论
1.1 蛋白质纯化的意义
1.2 纯化蛋白质常用的方法
1.3 蛋白质纯化的设计
1.3.1 基本原则
1.3.2 过程优化
1.3.3 经济性
1.4 规模化蛋白质纯化
1.4.1 基本原则
1.4.2 主要操作过程
2 蛋白质样品的预处理
2.1 蛋白质样品的提取和分离
2.1.1 细胞的破碎
2.1.2 蛋白质样品的分离
2.2 蛋白质样品的浓缩
2.2.1 吸附法
2.2.2 超滤法
2.2.3 沉淀法
2.2.4 透析法
2.2.5 冷冻干燥法
2.2.6 双水相分离法
2.3 蛋白质样品的沉淀
2.3.1 盐析法
2.3.2 有机溶剂沉淀法
2.3.3 等电点沉淀法
2.3.4 聚乙二醇沉淀法
2.3.5 选择性沉淀法
2.4 蛋白质样品的透析
2.4.1 基本原理
2.4.2 应用
3 凝胶过滤色谱
3.1 概述
3.1.1 基本原理
3.1.2 凝胶的性质和种类
3.1.3 凝胶介质的选择
3.2 凝胶柱的操作
3.2.1 装柱
3.2.2 样品和缓冲液的准备
3.2.3 色谱条件
3.2.4 加样和洗脱
3.2.5 凝胶柱的再生及保存
3.3 应用
3.3.1 脱盐
3.3.2 蛋白质分离
3.3.3 测定蛋白质分子量
3.3.4 蛋白质复性的研究
3.3.5 其他
4 离子交换色谱
4.1 基本概念
4.1.1 蛋白质的电性质
4.1.2 离子交换理论
4.1.3 离子交换的分辨率
4.2 固定相:离子交换剂
4.2.1 基本结构
4.2.2 功能基团和酸碱性质
4.2.3 离子交换剂的部分性质
4.2.4 离子交换剂的类型
4.3 流动相:缓冲液和盐
4.3.1 缓冲液的类型
4.3.2 缓冲液的pH和浓度
4.3.3 离子对色谱行为的影响
4.3.4 添加剂
4.4 实验方案设计
4.4.1 离子交换剂的选择
4.4.2 缓冲液的选择和色谱条件的确定
4.4.3 色谱柱的尺寸
4.4.4 分批分离
4.5 色谱技术
4.5.1 离子交换剂的准备
4.5.2 样品的准备
4.5.3 加样
4.5.4 洗脱技术
4.5.5 样品的收集和处理
4.5.6 离子交换剂的再生、清洗、消毒和储存
4.6 应用实例
4.6.1 用DEAE-Sepharose色谱分离真菌纤维素酶
4.6.2 用 MonoS和MonoQ连续色谱法从鸡肌肉组织分级分离糖酵解酶类
4.6.3 用 MonoQ阴离子交换分离白血病细胞N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的同工酶
4.6.4 用Bio-Rex70色谱分离眼镜蛇神经毒素的六种单乙酰基衍生物
4.6.5 用阶段洗脱法大规模纯化人血清白蛋白和免疫球蛋白G
5 亲和色谱
5.1 亲和吸附剂
5.1.1 配体和载体的选择
5.1.2 亲和吸附剂的制备方法
5.1.3 商品化基团特异性吸附剂
5.2 色谱技术
5.2.1 亲和色谱操作过程
5.2.2 亲和色谱的操作注意事项
5.2.3 亲和色谱的吸附容量与吸附效率
5.3 亲和色谱的特殊类型
5.3.1 凝集素亲和色谱
5.3.2 免疫亲和色谱
5.3.3 环氧乙烷丙烯酰胺珠亲和色谱
5.3.4 金属螯合亲和色谱
5.3.5 疏水作用色谱
5.4 应用
5.4.1 抗体和抗原的纯化
5.4.2 酶的纯化
5.4.3 糖蛋白的纯化
5.4.4 脂蛋白的纯化
6 共价色谱
6.1 巯基的化学性质
6.1.1 离子化、氧化、金属联结、烷基化
6.1.2 巯基捕硫化物互换反应
6.1.3 与活性二硫化物的反应
6.1.4 巯基与二硫氧化物的反应
6.2 含巯基的蛋白质
6.2.1 生物体中的氧化还原态
6.2.2 胞内与胞外的蛋白质
6.2.3 蛋白质巯基基团的解蔽
6.2.4 蛋白质二硫键的还原
6.2.5 巯基的引入
6.2.6 巯基基团的衍生化作用
6.3 共价色谱的凝胶
6.3.1 原理
6.3.2 凝胶的基质
6.3.3 凝胶的固定相
6.3.4 固定相活性基团的比较
6.3.5 凝胶固定相的引入
6.3.6 凝胶的取代程度和实际容量
6.4 色谱技术
6.4.1 预备
6.4.2 蛋白样品的结合
6.4.3 洗涤
6.4.4 还原洗脱
6.4.5 巯基蛋白的回收
6.4.6 巯基凝胶的再生
6.4.7 反向共价色谱
6.5 应用实例
6.5.1 从刀豆中分离脲酶
6.5.2 木瓜蛋白酶的纯化
6.5.3 共价色谱的顺序洗脱
6.5.4 巯基多肽的纯化
6.5.5 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的可逆固定
6.5.6 蛋白质亚基的鉴定
7 电泳技术
7.1 概述
7.1.1 原理
7.1.2 分类
7.1.3 介质
7.1.4 电泳仪器
7.1.5 染色方法
7.2 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
7.2.1 原理
7.2.2 常规PAGE的类型
7.2.3 影响分离结果的外在因素
7.2.4 蛋白质分子量的测定
7.2.5 常规PAGE的实验方法
7.2.6 PAGE的应用范围
7.3 SDS簿郾烯酰胺凝胶电泳
7.3.1 原理
7.3.2 SDS-PAGE的类型
7.3.3 影响分离结果的外在因素
7.3.4 蛋白质分子量的测定
7.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法
7.3.6 SDS-PAGE的应用范围
7.4 等电聚焦
7.4.1 原理
7.4.2 载体两性电解质pH梯度的形成
7.4.3 载体两性电解质等电聚焦方法
7.4.4 固相pH梯度的介质及其pH梯度的形成
7.4.5 固相pH梯度等电聚焦方法
7.4.6 等电聚焦的应用范围
7.5 双向电泳
7.5.1 原理
7.5.2 双向电泳实验方法
7.5.3 应用
7.6 免疫电泳
7.6.1 原理
7.6.2 电泳方法
7.6.3 应用
7.7 蛋白质印迹
7.7.1 原理
7.7.2 试验材料的选择
7.7.3 蛋白质印迹试验方法
7.7.4 应用
7.8 毛细管电泳
8 特殊用途蛋白质的纯化
8.1 测序用蛋白质的纯化
8.1.1 测序蛋白纯化技术
8.1.2 多肽的制备和纯化
8.2 用于晶体学研究的蛋白质纯化
8.2.1 蛋白质结晶方法
8.2.2 不均一性对蛋白质结晶的影响
8.3 融合蛋白的纯化
8.3.1 融合蛋白的纯化过程
8.3.2 蛋白质的水解保护
8.3.3 常用融合技术
8.3.4 融合蛋白纯化实例
8.4 包含体的初步纯化
8.4.1 影响包含体形成的因素
8.4.2 细胞匀浆中包含体的分离
8.4.3 包含体的洗涤
8.5 膜蛋白的纯化
8.5.1 蛋白质的溶解性
8.5.2 膜蛋白的纯化
8.6 治疗用蛋白质的纯化
8.6.1 治疗用蛋白纯化的关键问题
8.6.2 工艺确认
9 不同来源蛋白质的纯化
9.1 微生物细胞培养蛋白质的纯化
9.1.1 色谱纯化方法
9.1.2 蛋白质离子交换纯化
9.2 哺乳动物细胞培养蛋白质的纯化
9.2.1 工艺设计
9.2.2 细胞分离
9.2.3 产品的初步回收和分离
9.2.4 主要纯化方法
9.2.5 样品纯化举例——单克隆抗体的纯化
9.2.6 消除污染
9.3 动物组织蛋白质的纯化
9.3.1 组织的选择
9.3.2 组织破碎
9.3.3 防止蛋白质的有害水解
9.3.4 亚细胞分级分离
9.3.5 膜蛋白的溶解
9.3.6 动物蛋白质纯化举例
9.4 植物组织蛋白质的纯化
9.4.1 影响植物组织蛋白质纯化的因素
9.4.2 材料来源
9.4.3 确定植物蛋白种类的直接和间接策略
9.4.4 样品纯化举例
10 蛋白质的常用指标分析
10.1 蛋白质的含量分析
10.1.1 测定蛋白质浓度的方法
10.1.2 紫外分光光度法
10.1.3 Lowry法
10.1.4 二喹啉甲酸检测法
10.1.5 考马斯亮蓝染色法
10.2 蛋白质的分子量测定
10.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
10.2.2 凝胶过滤色谱法测定天然蛋白质的分子量
10.3 蛋白质的等电点测定
10.3.1 蛋白质的等电点
10.3.2 等电聚焦技术
10.3.3 超薄聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定蛋白质的等电点
10.4 蛋白质的纯度分析
10.4.1 纯度标准
10.4.2 常用的纯度检测方法
10.5 糖蛋白质中的糖含量分析
10.5.1 糖蛋白的化学分析
10.5.2 SDS凝胶中的糖蛋白染色法
10.6 蛋白质和肽的N末端氨基酸测定
10.6.1 FDNB法
10.6.2 DNS分析法
10.6.3 Edman降解法
10.7 蛋白质N末端序列分析
10.7.1 DNS-Edman法
10.7.2 DABITC/PITC双偶合法
10.8 蛋白质和肽的C末端分析
10.8.1 概述
10.8.2 C末端序列分析的羧肽酶Y法
11 实验部分
11.1 用于蛋白质纯化的仪器(工作站)
11.1.1 蛋白质纯化系统的主要部件
11.1.2 几种常见的蛋白质色谱系统
11.2 蛋白质分离纯化实例
11.2.1 蔗糖酶的分离纯化
11.2.2 转谷氨酰胺酶的分离纯化
11.2.3 纯化重组蛋白Pseudomonasaeruginosa外毒素A
11.2.4 E.coli中RNA聚合酶的提取和纯化
11.2.5 从E.coli中分离制备高纯度的去乙酰头孢菌素C合成酶
参考文献
1.1 蛋白质纯化的意义
1.2 纯化蛋白质常用的方法
1.3 蛋白质纯化的设计
1.3.1 基本原则
1.3.2 过程优化
1.3.3 经济性
1.4 规模化蛋白质纯化
1.4.1 基本原则
1.4.2 主要操作过程
2 蛋白质样品的预处理
2.1 蛋白质样品的提取和分离
2.1.1 细胞的破碎
2.1.2 蛋白质样品的分离
2.2 蛋白质样品的浓缩
2.2.1 吸附法
2.2.2 超滤法
2.2.3 沉淀法
2.2.4 透析法
2.2.5 冷冻干燥法
2.2.6 双水相分离法
2.3 蛋白质样品的沉淀
2.3.1 盐析法
2.3.2 有机溶剂沉淀法
2.3.3 等电点沉淀法
2.3.4 聚乙二醇沉淀法
2.3.5 选择性沉淀法
2.4 蛋白质样品的透析
2.4.1 基本原理
2.4.2 应用
3 凝胶过滤色谱
3.1 概述
3.1.1 基本原理
3.1.2 凝胶的性质和种类
3.1.3 凝胶介质的选择
3.2 凝胶柱的操作
3.2.1 装柱
3.2.2 样品和缓冲液的准备
3.2.3 色谱条件
3.2.4 加样和洗脱
3.2.5 凝胶柱的再生及保存
3.3 应用
3.3.1 脱盐
3.3.2 蛋白质分离
3.3.3 测定蛋白质分子量
3.3.4 蛋白质复性的研究
3.3.5 其他
4 离子交换色谱
4.1 基本概念
4.1.1 蛋白质的电性质
4.1.2 离子交换理论
4.1.3 离子交换的分辨率
4.2 固定相:离子交换剂
4.2.1 基本结构
4.2.2 功能基团和酸碱性质
4.2.3 离子交换剂的部分性质
4.2.4 离子交换剂的类型
4.3 流动相:缓冲液和盐
4.3.1 缓冲液的类型
4.3.2 缓冲液的pH和浓度
4.3.3 离子对色谱行为的影响
4.3.4 添加剂
4.4 实验方案设计
4.4.1 离子交换剂的选择
4.4.2 缓冲液的选择和色谱条件的确定
4.4.3 色谱柱的尺寸
4.4.4 分批分离
4.5 色谱技术
4.5.1 离子交换剂的准备
4.5.2 样品的准备
4.5.3 加样
4.5.4 洗脱技术
4.5.5 样品的收集和处理
4.5.6 离子交换剂的再生、清洗、消毒和储存
4.6 应用实例
4.6.1 用DEAE-Sepharose色谱分离真菌纤维素酶
4.6.2 用 MonoS和MonoQ连续色谱法从鸡肌肉组织分级分离糖酵解酶类
4.6.3 用 MonoQ阴离子交换分离白血病细胞N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的同工酶
4.6.4 用Bio-Rex70色谱分离眼镜蛇神经毒素的六种单乙酰基衍生物
4.6.5 用阶段洗脱法大规模纯化人血清白蛋白和免疫球蛋白G
5 亲和色谱
5.1 亲和吸附剂
5.1.1 配体和载体的选择
5.1.2 亲和吸附剂的制备方法
5.1.3 商品化基团特异性吸附剂
5.2 色谱技术
5.2.1 亲和色谱操作过程
5.2.2 亲和色谱的操作注意事项
5.2.3 亲和色谱的吸附容量与吸附效率
5.3 亲和色谱的特殊类型
5.3.1 凝集素亲和色谱
5.3.2 免疫亲和色谱
5.3.3 环氧乙烷丙烯酰胺珠亲和色谱
5.3.4 金属螯合亲和色谱
5.3.5 疏水作用色谱
5.4 应用
5.4.1 抗体和抗原的纯化
5.4.2 酶的纯化
5.4.3 糖蛋白的纯化
5.4.4 脂蛋白的纯化
6 共价色谱
6.1 巯基的化学性质
6.1.1 离子化、氧化、金属联结、烷基化
6.1.2 巯基捕硫化物互换反应
6.1.3 与活性二硫化物的反应
6.1.4 巯基与二硫氧化物的反应
6.2 含巯基的蛋白质
6.2.1 生物体中的氧化还原态
6.2.2 胞内与胞外的蛋白质
6.2.3 蛋白质巯基基团的解蔽
6.2.4 蛋白质二硫键的还原
6.2.5 巯基的引入
6.2.6 巯基基团的衍生化作用
6.3 共价色谱的凝胶
6.3.1 原理
6.3.2 凝胶的基质
6.3.3 凝胶的固定相
6.3.4 固定相活性基团的比较
6.3.5 凝胶固定相的引入
6.3.6 凝胶的取代程度和实际容量
6.4 色谱技术
6.4.1 预备
6.4.2 蛋白样品的结合
6.4.3 洗涤
6.4.4 还原洗脱
6.4.5 巯基蛋白的回收
6.4.6 巯基凝胶的再生
6.4.7 反向共价色谱
6.5 应用实例
6.5.1 从刀豆中分离脲酶
6.5.2 木瓜蛋白酶的纯化
6.5.3 共价色谱的顺序洗脱
6.5.4 巯基多肽的纯化
6.5.5 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的可逆固定
6.5.6 蛋白质亚基的鉴定
7 电泳技术
7.1 概述
7.1.1 原理
7.1.2 分类
7.1.3 介质
7.1.4 电泳仪器
7.1.5 染色方法
7.2 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
7.2.1 原理
7.2.2 常规PAGE的类型
7.2.3 影响分离结果的外在因素
7.2.4 蛋白质分子量的测定
7.2.5 常规PAGE的实验方法
7.2.6 PAGE的应用范围
7.3 SDS簿郾烯酰胺凝胶电泳
7.3.1 原理
7.3.2 SDS-PAGE的类型
7.3.3 影响分离结果的外在因素
7.3.4 蛋白质分子量的测定
7.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法
7.3.6 SDS-PAGE的应用范围
7.4 等电聚焦
7.4.1 原理
7.4.2 载体两性电解质pH梯度的形成
7.4.3 载体两性电解质等电聚焦方法
7.4.4 固相pH梯度的介质及其pH梯度的形成
7.4.5 固相pH梯度等电聚焦方法
7.4.6 等电聚焦的应用范围
7.5 双向电泳
7.5.1 原理
7.5.2 双向电泳实验方法
7.5.3 应用
7.6 免疫电泳
7.6.1 原理
7.6.2 电泳方法
7.6.3 应用
7.7 蛋白质印迹
7.7.1 原理
7.7.2 试验材料的选择
7.7.3 蛋白质印迹试验方法
7.7.4 应用
7.8 毛细管电泳
8 特殊用途蛋白质的纯化
8.1 测序用蛋白质的纯化
8.1.1 测序蛋白纯化技术
8.1.2 多肽的制备和纯化
8.2 用于晶体学研究的蛋白质纯化
8.2.1 蛋白质结晶方法
8.2.2 不均一性对蛋白质结晶的影响
8.3 融合蛋白的纯化
8.3.1 融合蛋白的纯化过程
8.3.2 蛋白质的水解保护
8.3.3 常用融合技术
8.3.4 融合蛋白纯化实例
8.4 包含体的初步纯化
8.4.1 影响包含体形成的因素
8.4.2 细胞匀浆中包含体的分离
8.4.3 包含体的洗涤
8.5 膜蛋白的纯化
8.5.1 蛋白质的溶解性
8.5.2 膜蛋白的纯化
8.6 治疗用蛋白质的纯化
8.6.1 治疗用蛋白纯化的关键问题
8.6.2 工艺确认
9 不同来源蛋白质的纯化
9.1 微生物细胞培养蛋白质的纯化
9.1.1 色谱纯化方法
9.1.2 蛋白质离子交换纯化
9.2 哺乳动物细胞培养蛋白质的纯化
9.2.1 工艺设计
9.2.2 细胞分离
9.2.3 产品的初步回收和分离
9.2.4 主要纯化方法
9.2.5 样品纯化举例——单克隆抗体的纯化
9.2.6 消除污染
9.3 动物组织蛋白质的纯化
9.3.1 组织的选择
9.3.2 组织破碎
9.3.3 防止蛋白质的有害水解
9.3.4 亚细胞分级分离
9.3.5 膜蛋白的溶解
9.3.6 动物蛋白质纯化举例
9.4 植物组织蛋白质的纯化
9.4.1 影响植物组织蛋白质纯化的因素
9.4.2 材料来源
9.4.3 确定植物蛋白种类的直接和间接策略
9.4.4 样品纯化举例
10 蛋白质的常用指标分析
10.1 蛋白质的含量分析
10.1.1 测定蛋白质浓度的方法
10.1.2 紫外分光光度法
10.1.3 Lowry法
10.1.4 二喹啉甲酸检测法
10.1.5 考马斯亮蓝染色法
10.2 蛋白质的分子量测定
10.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
10.2.2 凝胶过滤色谱法测定天然蛋白质的分子量
10.3 蛋白质的等电点测定
10.3.1 蛋白质的等电点
10.3.2 等电聚焦技术
10.3.3 超薄聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定蛋白质的等电点
10.4 蛋白质的纯度分析
10.4.1 纯度标准
10.4.2 常用的纯度检测方法
10.5 糖蛋白质中的糖含量分析
10.5.1 糖蛋白的化学分析
10.5.2 SDS凝胶中的糖蛋白染色法
10.6 蛋白质和肽的N末端氨基酸测定
10.6.1 FDNB法
10.6.2 DNS分析法
10.6.3 Edman降解法
10.7 蛋白质N末端序列分析
10.7.1 DNS-Edman法
10.7.2 DABITC/PITC双偶合法
10.8 蛋白质和肽的C末端分析
10.8.1 概述
10.8.2 C末端序列分析的羧肽酶Y法
11 实验部分
11.1 用于蛋白质纯化的仪器(工作站)
11.1.1 蛋白质纯化系统的主要部件
11.1.2 几种常见的蛋白质色谱系统
11.2 蛋白质分离纯化实例
11.2.1 蔗糖酶的分离纯化
11.2.2 转谷氨酰胺酶的分离纯化
11.2.3 纯化重组蛋白Pseudomonasaeruginosa外毒素A
11.2.4 E.coli中RNA聚合酶的提取和纯化
11.2.5 从E.coli中分离制备高纯度的去乙酰头孢菌素C合成酶
参考文献
蛋白质纯化技术及应用
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